روش کروماتوگرافی (صعودی ، نزولی یا افقی)
تصمیم گیری شخص آزمایش‌گر و وسایل موجود در مورد اینکه چه روشی برای یک آزمایش معین باید به کار رود، احتمالا از نکات اولیه است. تناوب خیلی کمی در نتایج به دست آمده از کروماتوگرافی صعودی و نزولی وجود دارد ولی زمان صرف شده متفاوت است. زمان صرف شده عمدتا به نوع
حلال و
کاغذ بستگی دارد. ولی برای یک مجموعه مشخص کاغذ-حلال روش نزولی سریع‌تر از روش صعودی است. زمان عبور حلال در یک کرومتوگرام نزولی را با بریدن نوار کاغذ به طوری که یک فشردگی در بین مخزن و محل لکه نمونه به وجود آید، می‌توان افزایش داد.
برای جدا سازی‌های دو طرفه یا جدا سازی یک طرفه همزمان (صعودی) تعداد زیادی از نمونه‌های مختلف با همان حلال ، دستگاه قاب مربعی مناسب است. استفاده از ورقه‌ها و مخزن‌های بزرگ‌تر تنها زمانی ضرورت دارد که عبور حلال به مسافت کم برای انجام
کروماتوگرافی کافی به نظر نرسد، و در این صورت روش نزولی بهتر خواهد بود. برای جداسازی‌های کمی یا جداسازی‌هایی که در آنها تعادل دیر برقرار می‌شود، به نظر می‌سد که روش نزولی مطلوب باشد، همچنین موقعی که احتیاج به یک آزمایش طولانی باشد این روش بهترین است. زیرا
حلال می‌تواند از انتهای کاغذ لبریز شود.
نقش اولیه کاغذ این است که به عنوان نگه دارنده‌ای برای فاز ساکن عمل می‌کند.
سرعت عبور فاز متحرک بستگی به
گرانروی این فاز داشته و برای یک مخلوط حلال معین ، سرعت بستگی به |ساختار کاغذ|ماهیت فیزیکی کاغذ دارد. اگر برای افزایش
چگالی ،
الیاف کاغذ نزدیکتر به هم ساخته شوند، مساحت سطح آزاد و اندازه فضاها کاهش می‌یابد و سرعت عبور کم می‌شود. برعکس با ضخیم تر نمودن کاغذ بدون تغییر چگالی ، سرعت عبور افزایش می‌یابد. در انتخاب کاغذ باید تناسبی بین کارایی ماکسیمم و زمان لازم وجود داشته باشد.
انتخاب و تهیه حلال مناسب کروماتوگرافی
حلال متحرک معمولا مخلوطی است که شامل یک جزء اصلی آلی ،
آب ، ترکیبات مختلف اضافه شده مانند
اسیدها ،
بازها یا عوامل کمپلکس کننده برای افزایش حلالیت بعضی از اجسام یا کاهش بعضی دیگر است. ممکن است ضد اکسنده‌ها نیز اضافه شوند. یک حلال معمولا باید ارزان باشد، زیرا غالبا مقدار زیادی از آن مصرف می شود، به طور خالص قابل تهیه باشد، و نباید بیش از حد فرار باشد. زیرا در آن صورت احتیاج به برقراری تعادل با دقت بیشتر است، از طرف دیگر فراریت زیاد باعث می‌شود که حلال از ورقه بعد از آزمایش آسان‌تر خارج می شود و سرعت عبور آن به میزان زیاد تحت تاثیر تغییرات
دما نباشد.
تعادل در ظرف انتخاب شده
لازم است بررسی شود که تا چه حد مخلوط حلال اولیه و
کاغذ ، قبل از شروع عمل ، باید با محیط در حالت تعادل قرار بگیرند. زمان لازم برای به تعادل رسیدن محیط با حلال بستگی به اندازه مخزن و فراریت حلال دارد. اگر مخلوط‌های خیلی فرار به کار رود،
تبخیر از کاغذ سریع‌تر خواهد بود و
برقراری تعادل حائز اهمیت است.
تهیه نمونه
نمونه‌های جامد ، مانند
خاک‌ها ، یا
سلول‌های زیستی یا
مواد بافتی را با حلال خیس می‌کنند، یا از بعضی از روش‌های استاندارد استخراج استفاده می‌کنند، نمونه‌های مهم زیادی مانند
ادرار یا سایر
مایعات زیستی در
محیط‌های آبی هستند.
زمان عمل (گسترش) ، و مکان یابی و شناسایی
موفقیت یک
جداسازی کروماتوگرافی در نهایت بستگی به فرآیند مکان‌یابی دارد. البته اجسام رنگی به صورت
لکه‌های مجزا در آخر آزمایش قابل مشاهده هستند. اجسام بی‌رنگ احتیاج به
آشکارسازی شیمیایی یا فیزیکی دارند. کروماتوگرافی‌ها را باید قبل و بعد از اعمال هر روش دیگری به طور عادی زیر
نور فرابنفش بررسی کرد. روش فیزیکی که فقط برای
مواد رادیواکتیو قابل استفاده هستند، عبارت‌اند از
پرتونگاری خودکار و شمارش.
روش‌های شیمیایی آشکارسازی دارای بیشترین اهمیت هستند و واکنشگرهای به کار برده شده را معمولا واکنشگرهای مکان یاب می‌نامند. با انتخاب صحیح واکنشگر ، عمل آشکارسازی و شناسایی را می‌توان به طور همزمان انجام داد. قسمتی از کاغذ را که شامل جسم مجهول است بریده و جسم را با یک حلال مناسب شستشو می‌دهند محلول حاصل را می‌توان به روش شیمیایی بررسی کرد، یا می‌توان یک سری مخلوط را ، که هر کدام از آنها متشکل از جسم شاهد است تهیه نموده و
کروماتوگرام آنها را به دست آورد. به جز ماهیت کاغذ و حلال ، عوامل اصلی مؤثر بر
جداسازی مواد عبارت ان از:
دما ، اندازه ظرف ، زمان عمل و جهت
جریان حلال ، موفقیت نهایی آزمایش بستگی به کارایی روش آشکارسازی دارد.
ارزیابی مواد روی کاغذ
- مقایسه چشمی لکه :
محلول‌های شاهد ، دارای مقادیر معلومی از جسم مورد نظر هستند، باید از چندین محلول شاهد با غلظت‌های مختلف استفاده شود، هر یک از این محلول‌ها تمام اجزای موجود در محلول مورد آزمایش را داشته باشند. این روش بستگی به استاندارد کردن خیلی دقیق دارد. در صورت استاندارد کردن ، این روش ، مخصوصا در ارزیابی فلزات ، به طور شگفت آوری دقیق می باشد.
- اندازه گیری فیزیکی لکه‌های رنگی :
برای اندازه گیری مقدار ماده به کمک انعکاس یا به وسیله عبور نور از آنها می‌توان از طیف سنج‌های نوری به طور مستقیم یا با اندکی تغییر استفاده کرد.
- اندازه گیری مساحت لکه :
مساحت لکه متناسب با لگاریتم غلظت ماده در محلول اولیه می‌باشد. اندازه گیری مساحت ، به علت فقدان مرز دقیق مشکل می‌باشد.
- اندازه گیری‌های پرتوزای :
ساده ترین راه آشکار سازی اجسام پرتوزای ، بررسی نوار ، و علامت گذاری محل لکه‌ها می‌باشد.
مباحث مرتبط با عنوان
