| اساس این فن استفاده از جابجایی ذرات بار در یک محیط مایع یا نیمه جامد در تحت تاثیر یک پتانسیل برای جداسازی ذرات و ترکیبات مختلف بویژه پروتئین و پلی نوکلوتیدها است. جسمی که دارای بار الکتریکی مثبت است، به طرف قطب منفی و جسمی که دارای بار الکتریکی منفی است به طرف قطب مثبت میرود. الکتروفوز به صورتهای مختلفی انجام میشود که مهمترین آنها عبارتند از : الکتروفوز روی کاغذ ، الکتروفوز با دستگاه ، الکتروفوز روی ژل و مانند آن. |
اساس و کاربرد الکتروفوز
الکتروفوز از فنون بسیار مهمی است که پژوهشگران
بیو شیمی در 50 سال اخیر برای شناسایی و تعیین خلوص
ماکرومولکولها بکار بردهاند. اساس این فنون ، مطالعه حرکت مولکولهای باردار در یک
میدان الکتریکی است که متاثر از ماهیت شیمیایی ، بار الکتریکی ، اندازه و شکل ماکرومولکول میباشد. مولکول زیستی بسیاری نظیر پپتیدها و پروتئینها و
اسیدهای نوکلوئیک را میتوان با استفاده از این روشها شناسایی و تفکیک کرد. وقتی پروتئینها در
بافری با
PH غیر از PH ایزوالکتریک خود قرار میگیرند، باردار میشوند.
این مولکولهای باردار در میدان الکتریکی حرکت میکنند که این حرکت بستگی به تراکم بار (نسبت بار به وزن) آن مولکولها دارد و هر چه این تراکم بیشتر باشد، مولکول با سرعت بیشتری حرکت میکند. برای تعیین تعداد زیر واحدها ،
جرم مولکولی و بررسی فرم طبیعی پروتئینها از روشهای مختلف الکتروفورز استفاده میکنند. الکتروفوز اولیه ای که بکار برده شد، تحت عنوان
الکتروفوز با مرز متحرک نام گرفت که با مشکلات زیادی مواجه بود.
با به کار گرفتن محیطهای پیشتیبان یا نگهدارنده نظیر کاغذ ، استات سلولز ، سیلیکا ، آلومینا و ژلهای نظیر
نشاسته ، آگارز بوجود آمد و فن الکتروفوز منطقهای شکل گرفت (به دلیل اینکه در جریان الکتروفوز اجزای نمونه پروتئینی به صورت مناطق کاملا مجزایی از یکدیگر جدا میشوند).
ژل پلیآکریل آمید
از میان محیطهای نگهدارنده ژل ، پلی اکریل آمید مساعدترین شرایط لازم برای شناسایی پروتئینها را داشته است. استفاده از این ژل ، امروزه بسیار متداول است. این ژل از طریق
پلیمریزاسیون در حضور پرسولفات آمونیوم (به عنوان آغاز کننده) و
کاتالیزوری به نام
TEMED (تترامتیل اتیلن دیآمین) تشکیل میگردد. ژل حاصل ، بیرنگ ، شفاف ، مقاوم در برابر حرارت و افزایش قدرت یونی بافرها و مقاوم در برابر تغییرات وسیع PH بوده ، رنگآمیزی آن بسیار آسان میباشد.
مزایای این ژل این است که با تغییر در غلظت آکریل آمید و بیس آکریل آمید ، میتوان اندازه منافذ ژل را تغییر داد. یعنی اگر غلظت اکریل آمید بیشتر شود، قطر منافذ ژل کوچکتر میشود و بالعکس (بنابراین از قبل میتوان ژل مناسب برای نمونه خاص را تعیین کرده ، سپس اقدام به تهیه ژل کرد). لذا ژل در مقابل مولکولها همچون غربالی عمل میکند و همین خصوصیات است که باعث میشود پروتئینهایی با اندازه مختلف ولی تراکم بار یکسان بخوبی بر روی این ژل جدا شوند. بطور کلی الکتروفوز بر روی پلیآکریل آمید را میتوان به دو روش انجام داد.
الکتروفوز بر اساس بار الکتریکی
الکتروفوز و جداسازی نمونههای طبیعی پروتئینها ، بر اساس بار و اندازه
مولکول صورت میگیرد و هر چه نسبت بار به جرم مولکولی بیشتر باشد، حرکت مولکول در میدان الکتریکی بیشتر خواهد بود. این نوع الکتروفوز شرایط خاصی دارد و زمانی بکار میرود که شکل طبیعی و فعالیت زیستی پروتئینها محفوظ بماند.
الکتروفوز بر اساس جرم مولکولی
در سال 1969 ، "
وبر" و "
اکبرن" نشان دادند که الکتروفوز بر روی ژل پلیآکریل آمید در حضور پاککننده یونی
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) یا
لوریل سولفات ، یکی از ساده ترین و کارآمدترین روشها برای تعیین وزن مولکولی پروتئینهای نمونه است. پروتئینها در حضور این ماده غیرطبیعی (دناتوره) شده ، در حضور 2- مرکاپتواتانل یا دیتیوتریتول ، باندهای دیسولفیدی آنها
احیا میشود و به صورت زیر واحدها و پلیپپتیدهای با ساختمان اول در میآیند.
SDS از قسمت غیرطبیعی خود به نواحی غیرقطبی زنجیرهای پروتئین متصل میشود و به صورت ماسکی با بار منفی تمام سطح
پروتئین را میپوشاند که بارهای روی مولکول پروتئین در مقایسه با بار منفی آن بسیار ناچیز میباشند و این در حالی است که بارهای مثبت آنرا نیز خنثی میکند لذا پلی پپتیدهای حاصل ، تقریبا از نظر تراکم بار یکسان میشوند و حرکت مولکولها در میدان الکتریکی ، متاثر از جرم مولکولی خواهد شد. بنابراین میتوان با استفاده از نمونههای استاندارد با وزن مولکولی مشخص ، جرم مولکولی پروتئین یا پلیپپتید را تعیین کرد.
مباحث مرتبط با عنوان
