کروماتوگرافی کاغذی (paper chromatoghraphy)

اطلاعات اولیه

انواع جداسازی های مختلف و ساده بر روی کاغذ به عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذی توصیف شده اند. این سیستم معمولا به عنوان نمونه بارزی از سیستم تقسیمی در نظر گرفته می شود که در آن فاز ساکن آب است و به وسیله جذب سطحی بر روی مولکول های سلولز قرار می گیرد و مولکول های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت های ثابت نگه داشته می شود. امروزه ، به هر حال ، مشخص شده است که جذب سطحی اجزای فاز متحرک و حل شونده ها و اثرات تبادل یون نیز نقش هایی را ایفا می کنند و کاغذ به هیچ عنوان تنها به صورت تکیه گاه بی اثر نیست.

سیر تحولی رشد

روش پیشنهادی رانگ در سال 1850و فرایندی که آن را تجزیه مویینه ای می نامند ، از جمله آنها می باشند. چنین روش هایی در واقع بیشتر شبیه کروماتوگرافی جذب سطحی بودند و کروماتوگرافی کاغذی به مفهوم فعلی ، گسترش سیستم تقسیمی است که به وسیله مارتین و سینج در سال 1941 ارائه شد. در سال 1944 کونسدن ، گوردن و مارتین اسیدهای آمینه و پپتید های موجود در محصول آبکافت پروتئین پشم را به وسیله روشی جدا کردند که در آن به جای ستون پودر از یک صفحه یا نوار کاغذی آویزان در داخل یک ظرف سرپوش دار استفاده شده بود.در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوط های ترکیبات آلی به کار رفت ولی بعد از آن ، عمدتا به وسیله برستال و پولارد وهمکاران آنها ، برای جداسازی یون های معدنی به سرعت به کار گرفته شد. هم آنیون ها و هم کاتیون ها را به وسیله این روش میتوان جدا کرد.

خصوصیت ویژه

یک خصوصیت ویژه روش کروماتوگرافی کاغذی این است که چیزی مربوط به محلول یا گاز خارج شده از ستون که در سیستم های معمول مایع یا گاز با آن برخورد می کنیم وجود ندارد.ترکیبات جدا شده روی کاغذ مکان یابی و شناسایی می شوند در نتیجه ، جداسازی به طور نسبتا دائم در روی کاغذ ثبت می شود. در این روش اجزای جدا شده جمع آوری نمی شوند و احتیاجی به وسایل پیچیده کنترل پیوسته نیست. اندازه گیری کمی ترکیبات جدا شده را می توان روی کاغذ انجام داد ولی اگر بخواهند اجرای را از کاغذ خارج کنند تنها کار لازم این است که قسمت مربوط به هر یک از اجسام را از کاغذ ببرند و هر یک را به طور جداگانه بشویند.

نکات مهم در کروماتوگرافی کاغذی

• نوع کاغذ: نقش اولیه کاغذ این است که به عنوان نگه دارنده ای برای فاز ساکن عمل می کند. سرعت عبور فاز متحرک بستگی به گرانروی این فاز داشته و برای یک مخلوط حلال معین ، سرعت بستگی به ماهیت فیزیکی کاغذ دارد. اگر برای افزایش چگالی ، الیاف کاغذ نزدیکتر به هم ساخته شوند ، مساحت سطح آزاد و اندازه فضاها کاهش می یابد و سرعت عبور کم می شود. برعکس با ضخیم تر نمودن کاغذ بدون تغییر چگالی ، سرعت عبور افزایش می یابد. در انتخاب کاغذ باید تناسبی بین کارایی ماکسیمم و زمان لازم وجود داشته باشد.
• انتخاب و تهیه حلال (فاز متحرک) :حلال متحرک معمولا مخلوطی است که شامل یک جزء اصلی آلی ، آب ، ترکیبات مختلف اضافه شده مانند اسیدها ، بازها یا عوامل کمپلکس کننده برای افزایش حلالیت بعضی از اجسام یا کاهش بعضی دیگر است. ممکن است ضد اکسنده ها نیز اضافه شوند. یک حلال معمولا باید ارزان باشد ، زیرا غالبا مقدار زیادی از آن مصرف می شود ، به طور خالص قابل تهیه باشد ، و نباید بیش از حد فرار باشد زیرا در آن صورت احتیاج به برقراری تعادل با دقت بیشتر است ، از طرف دیگر فراریت زیاد باعث می شود که حلال از ورقه بعد از آزمایش آسان تر خارج می شود و سرعت عبور آن به میزان زیاد تحت تاثیر تغییرات دما نباشد.
• تعادل در ظرف انتخاب شده :لازم است بررسی شود که تا چه حد مخلوط حلال اولیه و کاغد ، قبل از شروع عمل ، باید با محیط در حالت تعادل قرار بگیرند. زمان لازم برای به تعادل رسیدن محیط با حلال بستگی به اندازه مخزن و فراریت حلال دارد. اگر مخلوط های خیلی فرار به کار رود ، تبخیر از کاغذ سریع تر خواهد بود و برقراری تعادل حائز اهمیت است.
• تهیه نمونه : نمونه های جامد ، مانند خاک ها ، یا سلول های زیستی یا مواد بافتی را با حلال خیس می کنند ، یا از بعضی از روش های استاندارد استخراج استفاده می کنند ، نمونه های مهم زیادی مانند ادرار یا سایر مایعات زیستی در محیط های آبی هستند.
• زمان عمل (گسترش) ، و مکان یابی و شناسایی : موفقیت یک جداسازی کروماتوگرافی در نهایت بستگی به فرایند مکان یابی دارد. البته اجسام رنگی به صورت لکه های مجزا در آخر آزمایش قابل مشاهده هستند. اجسام بی رنگ احتیاج به آشکارسازی شیمیایی یا فیزیکی دارند. کروماتوگرافی ها را باید قبل و بعد از اعمال هر روش دیگری به طور عادی زیر نور فرابنفش بررسی کرد. روش فیزیکی که فقط برای اجسام پرتوزا قابل استفاده هستند عبارت اند از پرتونگاری خودکار و شمارش. روش های شیمیایی آشکارسازی دارای بیشترین اهمیت هستند و واکنشگر های به کار برده شده را معمولا واکنشگرهای مکان یاب می نامند. با انتخاب صحیح صحیح واکنشگر ، عمل آشکارسازی و شناسایی را می توان به طور همزمان انجام داد. قسمتی از کاغذ را که شامل جسم مجهول است بریده و جسم را با یک حلال مناسب شستشو می دهندمحلول حاصل را می توان به روش شیمیایی بررسی کرد ، یا می توان یک سری مخلوط را ، که هر کدام از آن ها متشکل از جسم شاهد است تهیه نموده و کروماتوگرام آن ها را به دست آورد.

به جز ماهیت کاغذ و حلال ، عوامل اصلی مؤثر بر جداسازی عبارت ان از: دما ، اندازه ظرف ، زمان عمل و جهت جریان حلال ، موفقیت نهایی آزمایش بستگی به کارایی روش آشکارسازی دارد.

ارزیابی اجسام روی کاغذ

• مقایسه چشمی لکه: محلول های شاهد ، دارای مقادیر معلومی از جسم مورد نظر هستند ، باید از چندین محلول شاهد با غلظت های مختلف استفاده شود ، هر یک از این محلول ها تمام اجزای موجود در محلول مورد آزمایش را داشته باشند. این روش بستگی به استاندارد کردن خیلی دقیق دارد. در صورت استاندارد کردن ، این روش ، مخصوصا در ارزیابی فلزات ، به طور شگفت آوری دقیق می باشد.
• اندازه گیری فیزیکی لکه های رنگی : برای اندازه گیری مقدار جسم به کمک انعکاس یا به وسیله عبور نور از آنها می توان از طیف سنج های نوری به طور مستقیم یا با اندکی تغییر استفاده کرد.
• اندازه گیری مساحت لکه: مساحت لکه متناسب با لگاریتم غلظت جسم در محلول اولیه می باشد. اندازه گیری مساحت ، به علت فقدان مرز دقیق مشکل می باشد.
• اندازه گیری های پرتوزای : ساده ترین راه آشکار سازی اجسام پرتوزای ، بررسی نوار ، و علامت گذاری محل لکه ها می باشد.

خارج کردن جسم از کاغذ

روش های ارائه شده مستلزم به کارگیری یک واکنش گر مکان یاب شیمیایی برای تعیین محل لکه هستند ، و لکه های رنگی اساس ارزیابی را تشکیل می دهند. بعضی اوقات می توان کمپلکس را شستشو داد و به وسیله روش رنگ سنجی تخمین زد ، ولی اگر تغییر شیمیایی قابل قبول نباشد ماده تغییر نیافته را باید شستشو داد. عمل شستشو را می توان با وارد کردن تکه کاغذ در یک حلال ، به وسیله استخراج در یک دستگاه سوکسیله ، یا با استفاده از آرایش خاصی ، که در کاغذ یک جریان نزولی کروماتوگرافی ایجاد می نماید ، انجام داد. برای جداسازی های معدنی تکه های کاغذ را می توان به صورت خاکستر درآورده ، باقیمانده ها را در اسید حل کرد. نتایج این روش به اندازه روش شستشو خوب نیستند. از اینرو محلول های به دست آمده را می‌توان به وسیله هر روش مناسبی تجزیه کرد، روش هایی که اغلب به دنبال روش های کروماتوگرافی به کار می روند عبارتند از رنگ سنجی و قطبش نگاری. پیدا کردن یک روش کروماتوگرافی ، که بتواند به طور کمی تمامی اجزای یک مخلوط را جدا کند ، مطلقا ضروری نیست. ارزیابی کمی فلزات با قطبش نگاری و ارزیابی کمی اجسام آلی مشکل تر از فلزات است زیرا ، برای اجسام آلی ، روش های موجود برای آزمایش محلول حاصل از شستشو محدودتر هستند. ارزیابی مواد آلی معمولا بر روی کاغذ صورت می گیرند و بنابراین لازم است که هر جسمی از اجسام دیگر به طور کمی جدا شود.

روش کمی کروماتوگرافی کاغذی

کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یک جداسازی کمی ، بلکه مکان یابی و ارزیابی کمی اجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازه گیری کمی را می توان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روش های کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار می دهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایط استاندارد زمان و دما صورت گیرد. در تهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبت های اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل باید به طور استاندارد انجام گیرد ، طول عبور حلال در تمامی نوبت ها یکسان باشد ، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند ، و خشک کردن ورقه باید در یک زمان و دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگرمکان یاب (در صورت استفاده از لکه های رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یا قراردادن در معرض بخار آمونیاک ، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یک جداسازی کروماتوگرافی باید روی کاغذ قرار گیرد ، متغیر است.

موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی

منابع علمی مربوط به روش های تجزیه ای و بررسی ترکیبات طبیعی نشان می دهد که کروماتوگرافی کاغذی در هر رشته ای
کاربرد دارد. با این همه ، این روش هنوز هم در جداسازی های مواد با ماهیت زیستی وسیع ترین کاربرد را دارد. کروماتوگرافی کاغذی اکثرا به عنوان یک وسیله تحقیقاتی به کار می رود ، و به طور گسترده ای در تجزیه های روزمره مخصوصا در جداسازی های جدیدی که هیچ روش کلاسیک برای آنها وجود ندارد ، نیز مورد استفاده قرار می گیرد. کلینیکی
و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین. آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند ، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدهادر آزمایش اسیدهای نوکلئیک ، جداسازی استرئیدها ، تجزیه عمومی ، تجزیه بسپارها ، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک ها و نمونه های زمین شناسی ، بررسی مواد فنولی در عصاره های گیاهی ، جداسازی آلکالوئیدها ، جداسازی ترکیبات علامت دار به وسیله رادیو ایزوتوپ ها، کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی اجسام فرار غیر فعال مانند هیدروکربن ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر مناسب نمی باشد.