دید کلی

کروماتوگرافی ستونی یکی از مهمترین روشهاتی جداسازی ترکیبات در آزمایشگاههای سنتز مواد است. متاسفانه این روش در آزمایشگاههای آموزشی کمتر استفاده می‌شود. زیرا مدرسان باید بین نسخه ناقص ، کروماتوگرافی ستونی ثقلی و فنون جدید نظیر کروماتوگرافی آنی و کروماتوگرافی با فشار متوسط که نیاز به لوازم شیشه‌ای مخصوص و گران‌قیمت و ستونهای مخاطره انگیز دارد، یکی را انتخاب کنند.

روش ساده دیگری که کمتر شناخته شده است، کروماتوگرافی آنی با ستون خشک است. این روش همان قدرت جداسازی روشهای پیشرفته را داراست، ولی به صورت قابل ملاحظه‌ای کم‌خطر و ارزانتر از آنهاست. همچنین یادگیری و استفاده از آن آسان است. از آنجا که کروماتوگرافی آنی با ستون خشک در هیچ یک از متن‌های آزمایشگاهی مقدماتی توضیح داده نشده است، در اینجا سازگاری این روش را برای آزمایشگاهی آموزشی شرح دهیم.

روش کار

روش کار عمومی روش کروماتوگرافی آنی با ستون در انباشتن ستون ، نشاندن نمونه و شستشوی ستون شبیه انواع کروماتوگرافی است. به هر حال این ستون شامل ستون شبیه انواع دیگر کروماتوگرافی‌هاست. به هر حال ، این ستون شامل یک بستر خشک از سیلیکاژل در یک قیف شیشه‌ای متخلخل است که با استفاده از مکش شویش و پس از هر جزء ستون خشک می‌شود.

این ویژگی‌ها باعث می‌شود تا ستون ، راحت‌تر انباشته شود و لازم نیست دانشجویان ، نگران پایین آمدن سطح حلال از سطح سیلیکاژل باشند. در نتیجه استفاده کنندگان تازه‌کار ، بدون مشکل خاصی نتایج رضات بخشی بدست می‌آورند و به‌آسانی جداسازی‌هایی انجام می‌دهند که قابل مقایسه با نتایج جداسازی با کروماتوگرافی لایه نازک است.

وسایل

ستون شامل سیلیکاژل (مرک با نمره 60) است که درون قیف شیشه‌ای متخلخل با قطر 4cm و با خلل و فرج متوسط انباشته می‌شود. بقیه دستگاه ، شامل چندین لوله آزمایش میلی‌متری و شیشه‌آلات صافی خلاء استاندارد است. حلال شویش ، مخلوطی از حلال قطبی و حلال ناقطبی است، (مثلا می‌توان از هگزان و اتیل استات استفاده کرد.) مزیت این دو حلال در این است که فشار بخار مشابهی دارند و در ضمن در همه آزمایشگاهها می‌توان را بازیابی کرد.

انباشتن ستون

قیف تا لبه با سیلیکاژل فشرده می شود (25 تا 30 گرم). در مرحله بعد با ضربات آهسته ای که به قیف زده می‌شود، گرد سیلیکاژل نشست کرده ، فضاهای خالی پر می‌شود. سپس مکش انجام می‌گیرد. مرحله نهایی ، انباشتن شامل فشردن محکم با یک میله شیشه‌ای ته‌صاف ، همزمان با بکارگیری مکش است. در نهایت ، انباشتن باید طوری انجام گیرد که سطح بستر متراکم شده ، حدود 1سانتی‌متر با لبه قیف فاصله داشته باشد، (اگر ضروری باشد مقداری از سیلیکاژل برداشته شود تا فضای لازم ایجاد شود). لازم نیست که سطح ستون حتما بصورت کاملا صاف در آید.

آزمون ستون

به منظور اطمینان از عدم وجود شیارها و فضاهای خالی در ستون ، بدقت روی بستر هگزان ریخته می‌شود و همزمان با بکارگیری مکش ، آزمون صورت می‌گیرد. سطح بستر تا زمانی که حلال (هگزان) شروع به خروج از انتهای قیف کند، باید پوشیده از حلال باشد. سپس افزایش هگزان قطع می‌شود و ستون تا خشک شدن کامل تحت مکش قرار می‌گیرد. اگر انباشتن ستون درست انجام گرفته باشد، جبهه هگزان در یک خط افقی نزول خواهد کرد و در نهایت ، بستر خشک به صورت یک دست و بدون ترک در خواهد آمد.br>
اگر هگزان در یک طرف بسیار سریعتر پایین بیاید یا اگر شیارها و فضاها در سطح بستر گسترش پیدا کند، در این صورت ستون با مکش کاملا خشک و بار دیگر از ابتدا انباشته می‌شود و دوباره آزمون صورت می‌گیرد.

محافظت از ستون

تشکیل یک گودی کوچک در وسط در طی افزایش حلال ، اجتناب ناپذیر است. با این حال می‌توان با گذاشتن کاغذ صافی و افزایش حلال روی این کاغذ ، تا حدی از ستون محافظت کرد.

نشاندن نمونه مخلوط

ساده ترین راه برای قرار دادن نمونه در ستون ، حل کردن نمونه در حجم اندکی از هگزان است (400mg از نمونه در 2 تا 3 میلی لیتر هگزان حل می‌شود). محلول را به آرامی در ستون بریزید و سپس مکش را بکارگیرید. برای نمونه‌هایی که در هگزان حل نمی‌شوند، می‌توان از مخلوط هگزان- اتیل استات استفاده کرد. نمونه با 3 تا 4 حجم از هگزان مخلوط و اتیل استات قطره قطره افزوده می‌شود تا نمونه حل شود و محلول بدست آمده همانند مورد قبل به ستون افزوده می‌شود (بهتر است ستون را با دو یا سه ستون هگزان پیش از شروع مرحله شویش شستشو داد).

راه دیگر برای نشاندن نمونه‌های نامحلول در هگزان ، جذب شدن آن نمونه در مقداری از سیلیکاژل تازه است. این کار بدین ترتیب انجام می‌گیرد که نمونه را در حلال قطبی حل کرده ، 5 هم ارز جرمی از سیلیکاژل می‌افزاییم تا ماده خمیر مانندی بدست آید و سپس حلال را تبخیر می‌کنیم. ژل خشک به صورت یکنواخت در قسمت بالای ستون گسترانده می‌شود.

شویش ستون

به محض آنکه نمونه روی ستون نشانده شد با استنفاده از مخلوطهای هگزان و اتیل استات که قطبیت آن به تدریج افزوده می‌شود، شویش ستون شروع می‌شود. معمولا دانشجویان ، جزءهای حلال را مستقیما در لوله های آزمایش میلی‌متری که در درون ارلن گذاشته می‌شود جمع آوری می‌کنند. بنابراین مجبور نیستید هر بار ، ارلن بشویند (صرفه جویی در حلال) و در ضمن ، خطر تداخل و آلودگی اجزای نمونه با یکدیگر حذف می‌شود.

شویش با استفاده از یک مکش قوی و ریختن 25 میلی‌لیتر از حلال شستشو به‌صورت آرام (بخش محافظت از ستون را ببینید) انجام می‌گیرد. به محض اینکه ستون کم و بیش خشک شد یا لوله آزمایش پر شد، مکش متوقف و لوله آزمایش برداشته می‌شود. اغلب مقداری از حلال از طریق تبخیر یا جذب کم می‌شود. بنابراین استفاده از مقادیر کم حلال برای افزودن به ستون عاقلانه نیست.

قطبیت حلال شستشو باید آهسته ، اما پیوسته و یکنواخت از یک جزء به جزء دیگر افزایش یابد. به عنوان نمونه ، می‌توان برای اولین حلال از هگزان استفاده کرد. سپس پیوسته مقدار اتیل استات را در جزء بعدی حدود 1 تا 2 درصد افزایش داد تا مخلوط ، شستشو یابد (افزایش بیشتر غلظت با مخلوطهای ساده‌تری نظیر فروسن و استیل فروسن امکان پذیر است).

مخلوط کردن اجزای حلال ، قسمت بزرگی از وقت تلف شده این روش را در بر می‌گیرد، اما با بکارگیری روش چهار مرحله‌ای زیر ، زمان مورد نیاز را بصورت قابل ملاحظه‌ای کوتاه می‌کند.

• مرحله 1 :صد میلی‌لیتر از مخلوط حلال که برای جزء X لازم است، در ظرف 100 میلی‌لیتری مدرج شده تهیه و 25 میلی لیتر از آن برای جزء X مصرف می‌شود.
  
  
• مرحله 2 :یک قسمت کوچک از اتیل استات (0,5 الی 1 میلی‌لیتر) به باقیمانده حلال افزوده می‌شود و 25 میلی‌لیتر از این مخلوط برای جزء X+1 استفاده می‌شود.
  
  
• مرحله 3 و 4 :همان عملیات مرحله 2 برای اجزای X+3 و X+2 تکرار می‌شود.
  
  

حال به مرحله اول برمی‌گردیم و یک مخلوط قطبی‌تر از X+3 درست می‌کنیم.

تشخیص نمونه

اگر اجزای نمونه رنگی باشد (فروسن و استیل فروسن) ، پیشرفت جداسازی با چشم دیده می‌شود. به هر حال ،‌ روش بسیار متداول جمع آوری 12 تا 16 نمونه و شناسایی همزمان آنها با TLC است.

کاربردها

این روش با موفقیت برای مخلوطهای در گستره 150 میلی‌گرم تا یک گرم بکار برده شده است، به شرط اینکه قطبیت حلال به تدریج افزوده شود. قدرت جداسازی ، همانند TLC خواهد بود. جداسازی‌ها می‌توانند شامل فروسن و استیل فروسن ، سیس و ترانس ، 3،3،5- تری متیل سیکلو هگزانول (که از کاهش کتون با NaBH₄ بدست آمده است) و جداسازی مخلوط مجهول دوتایی غیر رنگی (یکی از اجزای پروپیوفنون - اتیل بنزوآت - آنتول و جزء دیگر ارتو دی‌اتیل فتالات - ارتو دی متیلا فتالات با سینامیل الکل است) باشد.

در هر کدام از موارد بالا ، جداسازی کامل با موفقیت انجام می‌گیرد، بویژه جداسازی دیاسترومرهای سیکلوهگزال جالب است، زیرا NaBH₄ واکنشگری با دیاستریوگزینی متوسط است و دانشجویان با استفاده از NMR می‌توانند بین دو دیاستومر تفاوت قائل شوند. اگر چه در توصیف محدودیتهای این روش ، امکان تخریب اکسایشی وجود دارد، ولی ما این مورد را حتی درباره آنتول و سینامیل الکل مشاهده نکردیم.

مباحث مرتبط با عنوان

• جداسازی مواد
• کروماتوگرافی
• کروماتوگرافی ژلی